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/ 2017-01-18

 

 

一、pH值对发酵的影响

  发酵培养基的pH值,对微生物生长具有非常明显的影响,也是影响发酵过程中各种酶活的重要因素。pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面:①影响酶的活性,当pH值抑制菌体中某些酶的活性时,会阻碍菌体的新陈代谢;②影响微生物细胞膜所带电荷的状态,改变细胞膜的通透性,影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的排泄;③影响培养基中某些组分的解离,进而微生物对这些成分的吸收;④pH值不同,往往引起菌体代谢过程的不同,使代谢产物的质量和比例发生改变。
培养基中营养物质的代谢,是引起pH值变化的主要原因,发酵液pH值的变化乃是菌体代谢的综合效果。由于pH值不当,可能严重影响菌体的生长和产物的合成,因此对微生物发酵来说有各自的最适生长pH值和最适生产pH值。各种不同的微生物,对pH值的要求不同。多数微生物生长都有最适pH值范围及其变化的上下限:上限都在8.5左右,超过此上限,微生物将无法忍受而自溶;下限以酵母为最低(2.5)。但菌体内的pH值一般认为是中性附近。pH值对产物的合成有明显的影响,因为菌体生长和产物合成都是酶反应的结果,仅仅是酶的种类不同而已,因此代谢产物的合成也有自己最适的pH值范围,如合成青霉素的最适pH值范围为6.5~6.8。这两种pH值的范围对发酵控制来说都是很重要的参数。另外,pH值还会影响某些霉菌的形态。
一般认为,细胞内的H+或OH-能影响酶蛋白的解离度和电荷情况,改变酶的结构和功能,引起酶活性的改变。但培养基的H+或OH-并不是直接作用在胞内酶蛋白上,而是首先作用在胞外的弱酸(或弱碱)上,使之成为易于透过细胞膜的分子状态的弱酸(或弱碱),它们进入细胞后,再行解离,产生H+或OH-,改变胞内原先存在的中性状态,进而影响酶的结构和活性。所以培养基中H+或OH-是通过间接作用来产生影响的。pH值还影响菌体对基质的利用速率和细胞的结构,影响菌体的生长和产物的合成。Collnig等人发现产黄曲霉的细胞壁的厚度就随pH值的增加而减?。浩渚恐本对趐H6.0时为2~3μm;pH7.4时为2~18μm,并呈膨胀酵母状;pH值下降后菌丝形态又会恢复正常。pH值还影响菌体细胞膜的电荷状况,引起膜透性发生改变,因而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的形成等。
如同温度对发酵影响一样,pH值对产物稳定性也有影响。如在β-内酰胺抗生素沙纳霉素(thienamycin)的发酵中,考察pH值对产物生物合成的影响时,发现pH6.7~7.5之间,抗生素的产量相近,高于或低于这个范围,合成就受到抑制。在这个pH值范围内,沙纳霉素的稳定性未受到严重影响,半衰期也无大的变化;但pH>7.5时,稳定性下降,半衰期缩短,发酵单位也下降。青霉素在碱性条件下发酵单位低,也与青霉素的稳定性有关。
由于pH值的高低对菌体生长和产物的合成产生明显的影响,所以在工业发酵中,维持最适pH值已成为生产成败的关键因素之一。

二、发酵过程pH值的变化

  在发酵过程中,pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。在产生菌的代谢过程中,菌体本身具有一定的调整周围环境pH值,构建最适pH值的能力。曾以产生利福霉素SV的地中海诺卡菌进行发酵研究,采用pH值为6.0、6.8、7.5三个出发值,结果发现pH值在6.8、7.5时,最终发酵pH值都达到7.5左右,菌丝生长和发酵单位都达到正常水平;但pH值为6.0时,发酵中期pH值只达4.5,菌浓仅为20%,发酵单位为零。这说明菌体仅有一定的自调能力。
培养基中的营养物质的代谢,也是引起pH值变化的重要原因,发酵所用的碳源种类不同,pH值变化也不一样。如灰黄霉素发酵的pH值变化,就与所用碳源种类有密切关系,如以乳糖为碳源,乳糖被缓慢利用,丙酮酸堆积很少,pH值维持在6~7之间;如以葡萄糖为碳源,丙酮酸迅速积累,使pH值下降到3.6,发酵单位很低。
发酵液的pH值变化是菌体代谢反应的综合结果。从代谢曲线的pH值变化就可以推测发酵罐中的各种生化反应的进展和pH值变化异常的可能原因。在发酵过程中,要选择好发酵培养基的成分及其配比,并控制好发酵工艺条件,才能保证pH值不会产生明显的波动,维持在最佳的范围内,得到良好的结果。实践证明,维持稳定的pH值,对产物的形成有利。

三、发酵pH值的确定和控制

 ?、狈⒔蚿H值的确定
微生物发酵的最适pH值范围一般是在5~8之间,如谷氨酸发酵的最适pH值为7.5~8.0。但发酵的pH值又随菌种和产品不同而不同。由于发酵是多酶复合反应系统,各酶的最适pH值也不相同,因此,同一菌种,生长最适pH值可能与产物合成的最适pH值是不一样的。例如,黑曲霉pH2~3时合成柠檬酸,在pH值接近中性时积累草酸。谷氨酸生产菌在中性和微碱性条件下积累谷氨酸,在酸性条件下形成谷氨酰胺。谷氨酸发酵在不同阶段对pH值的要求不同,发酵前期控制pH7.5左右,发酵中期pH7.2左右,发酵后期pH7.0,在将近放罐时,为了后工序提取谷氨酸,pH6.5~6.8为好。如初级代谢产物丙酮丁醇的梭状芽孢杆菌发酵,pH值在中性时,菌种生长良好,但产物产量很低,实际发酵最适pH值为5~6。次级代谢产物抗生素的发酵更是如此,链霉素产生菌生长的最适pH值为6.2~7.0,而合成链霉素的最适pH值为6.8~7.3。因此,应该按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH值范围,使产物的产量达到最大。
最适pH值是根据实验结果来确定的。将发酵培养基调节成不同的出发pH值进行发酵,在发酵过程中,定时测定和调节pH值以维持出发pH值,或者利用缓冲液配制培养基来维持之。定时观察菌体的生长情况,以菌体生长达到最高值的pH值为菌体生长的最适pH值。以同样的方法,可测得产物合成的最适pH值。但同一产物的最适pH值,还与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。如合成青霉素的最适pH值,先后报告有7.2~7.5、7.0左右和6.5~6.6等不同数值,产生这样的差异,可能是所用的菌株、培养基组成和发酵工艺不同引起的。在确定发酵最适pH值时,要不定期考虑培养温度的影响,若温度提高或降低,最适pH值也可能发生变动。
⒉pH值的控制
在各种类型的发酵过程中,实验所得的最适pH值、菌体的比生长速率(μ)和产物比生成速率(Qp)等3个参数的相互关系有四种情况(见图7-3):①第一种情况是μ和Qp的最适pH值都在一个相似的较宽的适宜范围内(a),这种发酵过程易于控制;②第二种情况是Qp(或μ)的最适pH值范围很窄,而μ(或Qp)的范围较宽(b);③第三种情况是μ和Qp对pH值都很敏感,它们的最适pH值又是相同的(c),第二、第三种情况的发酵pH值应严格控制;④第四种情况更复杂,μ和Qp有各自的最适pH值(d),应分别严格控制各自的最适pH值,才能优化发酵过程。
在了解发酵过程中最适pH值的要求之后,就要采用各种方法来控制。首先需要考虑和试验发酵培养基的基础配方,使它们有个适当的配比,使发酵过程中的pH值变化在合适的范围内。因为培养基中含有代谢产酸[如葡萄糖产生酮酸、(NH4)2SO4]和产碱(如NaNO3、尿素)的物质以及缓冲剂(如CaCO3)等成分,它们在发酵过程中要影响pH值的变化,特别是CaCO3能与酮酸等反应,而起到缓冲作用,所以它的用量比较重要。在分批发酵中,常采用这种方法来控制pH值的变化。
利用上述方法调节pH值的能力是有限的,如果达不到要求,可以用在发酵过程中直接补加酸或碱和补料的方式来控制,特别是补料的方法,效果比较明显。过去是直接加入酸(如H2SO4)或碱(NaOH)来控制,但现在常用的是以生理酸性物质[(NH4)2SO4]和碱性物质(如氨水、尿素)来控制。它们不仅可以调节pH值,还可以补充氮源。当发酵的pH值和氨氮含量都低时,补加氨水,就可达到调节pH值和补充氨氮的目的;反之,pH值较高,氨氮含量又低时,就补加(NH4)2SO4。在加多了消泡剂(如豆油)的个别情况下,还可采用提高空气流量来加速脂肪酸的代谢,以调节pH值。通氨一般是使压缩氨气或工业用氨水(浓度20%左右),采用少量间歇添加或连续自动流加,可避免一次加入过多造成局部偏碱。氨极易和铜反应产生毒性物质,对发酵产生影响,故需避免使用铜制的通氨设备。
目前,已比较成功地采用补料的方法来调节pH值,如氨基酸发酵采用流加尿素[(NH2)2CO]的方法,特别是次级代谢产物抗生素发酵,更常用此法。这种方法,既可以达到稳定pH值的目的,又可以不断补充营养物质,特别是能产生阻遏作用的物质。少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用,提高产物产量。也就是说,采用补料的方法,可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH值和培养液的特性(如菌浓等)等几个目的。最成功的例子就是青霉素的补料工艺,利用控制葡萄糖的补加速率来控制pH值的变化范围(现已实现自动化),其青霉素产量比用恒定的加糖速率和加酸或碱来控制pH值的产量高25%。

 

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