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/ 2016-07-12

澳门新葡京娱乐网址现依托中国微生物菌种保藏中心拥有完善的菌种保藏设备,并开拓相关保藏业务主要接受为生物安全等级2级和2级以下的微生物菌种进行保藏。要求对于菌种的用途特征特性需备注清楚。我单位只能办理保藏的是长期保存其性状不发生明显变异的菌种。

微生物菌种保藏的基本原理在保藏过程中,必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态(使菌体不死、不衰、不变),在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能从而达到保藏目的。单位目前的保藏方法有液氮超低温冻结法、真空冷冻干燥法、-80°C冰箱冻结法等方法实现菌种的妥善保藏。

 

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亦称传代培养保藏法,包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中,最适条件下培养,待生长充分后,于4~6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

操作步骤如下:

1 培养基制备

1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿,如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等,经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。

1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水,按培养基配方称取各项材料,依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解,最后加足水量,搅拌均匀。

1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温,根据要求加稀酸(0.1mol/L盐酸)或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌,防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。

1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂,如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中,加热并不断搅拌至融解,再补足所蒸发水分。

1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉,将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4~5mL),穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口,以免弄湿棉塞造成污染。

1.6 包扎标记 将试管加棉塞,外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。

1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌,通常蒸汽灭菌为121℃,15~20min。

1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面,斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。

1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验,通常30℃培养1~3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。

2接种

2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌(如毛霉、根霉等)。 2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。

2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌,也适用于部分真菌。

2.1.4 密波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞,适用于细菌和酵母菌等。 2.1.5 挖块接种法 挖取菌丝体连同少量培养基,转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。

2.2 穿刺接种 用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体,从柱状培养基中心自上而下刺入,直到接近管底(勿穿到管底),然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。适用于细菌和酵母菌等。 2.3 液体接种 挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。

3 培养 将接种后的培养基放入培养箱中,在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30~37℃,真菌培养温度一般为25~28℃。

4 保藏 培养好的菌种于4~6℃保存,根据要求每3~6个月移植一次。某些菌种,如芽裂酵母,阿舒假囊酵母,棉病囊霉等,须1~3个月移植一次。 保藏湿度用相对湿度表示,通常为50%~70%。

斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照,防止因意外和污染造成损失。

 

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将菌种保藏在-80℃冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。

操作步骤如下: 1 安瓿管的准备 安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时,先用2%盐酸浸泡过夜,自来水冲洗干净后,用蒸馏水浸泡至pH中性,干燥后、贴上标签,标上菌号及时间,加入脱脂棉塞后,121℃下高压灭菌15-20分钟,备用。

2 ?;ぜ恋难≡窈妥急??;ぜ林掷嘁菸⑸锢啾鹧≡?。配制?;ぜ潦?,应注意其浓度及pH值,以及灭菌方法。如血清,可用过滤灭菌;牛奶要先脱脂,用离心方法去除上层油脂,一般在100℃间歇煮沸2-3次,每次10-30分钟,备用。

3 微生物保藏物的准备 在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期,进行纯度检查后(参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》(试行)),与?;ぜ粱旌暇?,分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜(以大肠杆菌为例,为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升,只需10毫升琼脂斜面两支)。采用较长的毛细滴管,直接滴入安瓿管底部,注意不要溅污上部管壁,每管分装量约0.1-0.2毫升,若是球形安瓿管,装量为半个球部。若是液体培养的微生物,应离心去除培养基,然后将培养物与?;ぜ粱煸?,再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短,最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。

4 冻结保藏 将安瓿管或塑料冻存管置于-80℃冰箱中保藏。 5 复苏方法 从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管,应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止,约需50秒-100秒??舭碴彻芑蛩芰隙炒婀?,将内容物移至适宜的培养基上进行培养。

 

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液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196℃的液态氮,或在-150℃的氮气中的长期保藏方法,它的原理是利用微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。

操作步骤如下: 1 安瓿管或冻存管的准备 用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管,或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净, 121℃下高压灭菌15-20分钟,备用。

2 ?;ぜ恋淖急??;ぜ林掷嘁菸⑸锢啾鹧≡?。配制?;ぜ潦?,应注意其浓度,一般采用10-20%甘油。

3 微生物保藏物的准备 微生物不同的生理状态对存活率有影响,一般使用静止期或成熟期培养物。 分装时注意应在无菌条件下操作。 菌种的准备可采用下列几种方法: 刮取培养物斜面上的孢子或菌体,与?;ぜ粱煸群蠹尤攵炒婀苣?; 接种液体培养基,振荡培养后取菌悬液与?;ぜ粱旌戏肿坝诙炒婀苣?; 将培养物在平皿培养,形成菌落后,用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块(直径约5-10毫米),真菌最好取菌落边缘的菌块,与?;ぜ粱煸群蠹尤攵炒婀苣?; 在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基,接种菌种,培养2-10天后,加入?;ぜ?,待保藏。

4 预冻 预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降1℃为好、使样品冻结到-35℃。 目前常用的有三种控温方法: —— 程序控温降温法,应用电子计算机程序控制降温装置,可以稳定连续降温,能很好地控制降温速率。 —— 分段降温法:将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却,或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温,将安瓿管或塑料小管,先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小时,然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟下降1-1.5℃。 —— 对耐低温的微生物、可以直接放入气相或液相氮中。

5 保藏

将安瓿管或塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150℃,液相中温度为-196℃。

6 复苏方法 从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管,应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止,一般约需50秒-100秒??舭碴彻芑蛩芰隙炒婀?,将内容物移至适宜的培养基上进行培养。